Sensitizing and anaphylactic capacity of egg proteins : processing and food matrix effects

Resumen

Egg allergy is defined as an adverse reaction of immunological nature that occurs reproducibly on exposure to egg proteins. Egg allergy is one of the most common food allergies in childhood and an increased prevalence have been observed during the last years. The management of egg allergy is food avoidance and treatment of allergic reactions in case of accidental exposure. The main problem is that egg is a common ingredient of a wide range of food products and its dietary avoidance can be challenging and could result in nutritional deficiency. The main allergens of egg are those present in egg white (EW) –ovalbumin (OVA), ovomucoid (OM) and lysozyme (LYS)- although egg yolk (EY), whose main components are lipids, can also contain allergenic proteins such as α-livetin and protein YGP-42. However, little is known about the relative allergenicity of the individual proteins and their contribution to the egg allergenic potential. In addition, egg proteins are commonly consumed after heating and in presence of other food components, such as lipids or carbohydrates. Mounting evidence has suggested that technological processes and food matrix can have an impact on the gastrointestinal digestion of food allergens and modify the way in which allergens are presented to the immune system, thus changing the allergen capacity to induce sensitization and anaphylaxis. In the present Doctoral Thesis, the mice strains most commonly employed for the study of food allergies, BALB/c and C3H/HeOuJ, were compared and its suitability for the study of the allergenic capacity of egg proteins was assessed. Mice sensitization was made by administering two different OVA doses (1 and 5 mg), with cholera toxin (CT) as Th2-polarizing adjuvant. Antibody levels, severity of anaphylaxis and Th1 and Th2 responses induced by the allergen were evaluated. In addition, because the mice selected had functional Toll-like receptor 4, the influence of contamination with lipopolysaccharide (LPS) Tesis doctoral de Alba Pablos Tanarro Sensitizing and anaphylactic capacity of egg proteins: processing and food matrix effect / Capacidad sensibilizante y anafiláctica de las proteínas del huevo: efecto del procesado y de la matriz alimentaria on the immunostimulating capacity of OVA on spleen cells was also considered. Results indicated that both strains exhibited similar susceptibility to OVA sensitization. The two protein doses generated similar OVA-specific IgE and IgG1 levels in both strains, whereas C3H/HeOuJ mice produced significantly more IgG2a. Oral challenge provoked more severe anaphylactic signs and body temperature drop in C3H/HeOuJ mice. Stimulation of splenocytes with OVA led to significantly higher levels of Th2 and Th1 cytokines in the BALB/c, and these were less affected by protein contamination with LPS. The immunogenic and allergenic properties of the most clinically relevant egg allergens –OVA, OM and LYS- and its input to the egg allergy development remain elusive. Therefore, throughout the next chapter, the ability of these proteins to induce sensitization and elicitation of the allergenic response in the mouse model was compared. BALB/c mice were orally administered either the individual egg allergens or a mixture of the three proteins in the same proportion, together with CT. The sensitizing effect of OVA, OM and LYS administered together with cholera toxin was associated with an increased duodenal expression of IL-33, TSLP, TGF-β and IL-10. The sole administration of CT up-regulated the production of IL-25 and IL-17, both at the small intestine. As compared to the other egg white allergens, OVA and OM, LYS promoted an early IgE and IgG1 production and more severe anaphylaxis upon challenge, as well as triggered a general higher Th2-biased cytokine production. Due to the fact that eggs are usually consumed after thermal processing, the next chapter of the present Doctoral Thesis focused on the impact of different technological processes leading to a limited denaturation on the allergenic capacity of egg white proteins. For this purpose, we compared the ability to sensitize and trigger allergic responses of raw egg white (REW), pasteurized egg white (HEW, 80ºC-10min) and high-pressure treated egg white (PEW, 400 mPa-10min). The results shown that the highest liberation of mast cell protease, as well as the most severe anaphylactic signs and body temperature drop, were observed in PEW sensitized and challenged mice. Moreover, splenocytes from mice Tesis doctoral de Alba Pablos Tanarro Sensitizing and anaphylactic capacity of egg proteins: processing and food matrix effect / Capacidad sensibilizante y anafiláctica de las proteínas del huevo: efecto del procesado y de la matriz alimentaria sensitized to PEW produced more Th2 cytokines, IL-4 and IL-5, than those from mice from the other groups in response to stimulation with the allergen. Regarding the humoral response, REW and PEW promoted the highest levels of specific IgG1 at the end of the sensitization protocol, while HEW stimulated the highest production of IgE. Passive cutaneous anaphylaxis test confirmed that IgG1 plays an important role on the allergic reactions to PEW and REW, whereas reactions to HEW were mediated by IgE to a higher extent. Finally, based on previous data that evidence that some food matrix compounds alter digestion and gastrointestinal absorption of allergens and that they act as adjuvants activating innate immunity and enhancing allergen-specific immune responses, the last part of this thesis aimed to compare the capacity of EW and EY to sensitize and trigger allergic reactions, paying attention to their mutual influence on the immune responses generated by egg. For this purpose, murine models of orally (with and without adjuvant), intraperitoneally and epicutaneously induced egg allergy were studied. Results obtained revealed that EY may play an important role during the sensitization phase rather than the effector phase of egg allergy. EY and EW:EY sensitized mice were more susceptible to develop sensitization to EW, as mice shown more severe anaphylactic response after challenge with EW, increase of GATA-3 and IL-4 expression and Th2 activated cells in mesenteric lymph nodes. In ex vivo stimulation, EY also boosted Th1 and Th2 cytokines production. In addition, EY, and its co-administration with EW, had a stimulatory effect on duodenal expression of IL-33. However, in the absence of mucosal adjuvant or using non-oral routes, EW, EY and their mixture, hold limited ability to generate antibody responses, showing restricted sensitizing capacity in mice. In all the cases, EY alone does not have the capacity to trigger anaphylactic reactions. Considering all together, the mixture EW:EY seems to be more immunogenic than EW and EY individually as judge by its T-priming effects. Tesis doctoral de Alba Pablos Tanarro Sensitizing and anaphylactic capacity of egg proteins: processing and food matrix effect / Capacidad sensibilizante y anafiláctica de las proteínas del huevo: efecto del procesado y de la matriz alimentaria RESUMEN La alergia al huevo es una reacción adversa causada por un mecanismo inmunológico que se produce por ingestión y/o contacto con huevo. Esta reacción se repite cada vez que el individuo alérgico tiene contacto con dicho alimento. La alergia al huevo es una de las alergias alimentarias más frecuentes en niños y se ha observado un aumento de su prevalencia en los últimos años. Una vez diagnosticada la alergia, el principal tratamiento hasta el momento consiste en la privación del alimento. Aunque se dispone de numerosos medicamentos para aliviar los síntomas, no se ha desarrollado ninguna terapia definitiva capaz de curar la alergia. En el caso del huevo, el principal problema radica en que se trata de un alimento muy ubicuo y su eliminación de la dieta podría resultar en deficiencias nutricionales. Los principales alérgenos del huevo se encuentran en la clara de huevo (EW) –ovoalbúmina (OVA), ovomucoide (OM) y lisozima (LYS)- aunque la yema (EY), compuesta mayoritariamente por lípidos, también pueden contener proteínas alergénicas como la α-livetina y la proteina YGP-42. Sin embargo, se desconoce la alergenicidad relativa de las proteínas individuales y su contribución al potencial alergénico del huevo. Además, las proteínas del huevo se suelen consumir calentadas y en presencia de otros componentes del alimento, lo que puede interferir en su digestión gastrointestinal, modificar la forma en que son presentadas al sistema inmune y alterar, así, su capacidad para sensibilizar y producir anafilaxia. En la presente Tesis Doctoral, dos cepas de ratón ampliamente empleadas para el estudio de las alergias alimentarias, BALB/c y C3H/HeOuJ, fueron comparadas y evaluadas para el estudio de las capacidades alergénicas de las proteínas de huevo. Para ello, se administraron dos dosis diferentes de OVA (1 y 5 mg) a los ratones, empleando toxina de cólera (CT) como adyuvante para estimular una respuesta de tipo Th2. Con el fin de estudiar el grado de sensibilización y anafilaxia, se analizaron los valores de Tesis doctoral de Alba Pablos Tanarro Sensitizing and anaphylactic capacity of egg proteins: processing and food matrix effect / Capacidad sensibilizante y anafiláctica de las proteínas del huevo: efecto del procesado y de la matriz alimentaria anticuerpos, la severidad de la reacción anafiláctica y el tipo de respuesta –Th1 y Th2- inducida por el alérgeno. Además, debido a que los ratones empleados tenían receptor Toll-like 4 funcional, se determinó la influencia de la contaminación con lipopolisacárido (LPS) sobre la capacidad inmunoestimulante de OVA sobre las células del bazo. Los resultados obtenidos indicaron que ambas cepas de ratón tenían una susceptibilidad similar de ser sensibilizadas a OVA. Las dos dosis de proteína generaron niveles similares de IgE e IgG1 específicas frente OVA en ambas cepas, mientras que la cepa C3H/HeOuJ presentó valores de IgG2a específica significativamente mayores. La provocación oral con OVA desencadenó una reacción anafiláctica más grave en los ratones de la cepa C3H/HeOuJ. La estimulación de los espenocitos con OVA indujo mayores niveles de citoquinas Th1 y Th2 en los ratones de la cepa BALB/c, y estos niveles se vieron menos afectados por la contaminación con LPS. Hasta el momento no se conoce con exactitud la capacidad de producir sensibilización y reacciones anafilácticas de los alérgenos del huevo más relevantes a nivel clínico (OVA, OM y LYS). Por ello, en el siguiente capítulo, se empleó el modelo animal seleccionado (BALB/c) para el estudio de dichas capacidades. Cada uno de los tres alérgenos fue administrado de forma individual o formando parte de una mezla de las tres proteínas en la misma proporción mediante sondaje intragástrico. La capacidad sensibilizante de cada una de las tres proteínas administradas junto con CT fue asociada con un incremento de la expresión de IL-33, TSLP, TGF-β e IL-10 en el duodeno. La administración de CT incrementó la producción de IL-25 e IL-17 en el intestino delgado. Por su parte, la LYS, en comparación con OVA y OM, promovió una producción más temprana de IgE e IgG1 específicas durante el protocolo de sensibilización, indujo una reacción anafiláctica más severa tras la provocación y estimuló una mayor producción de citoquinas de tipo Th2. El siguiente capítulo de la Tesis Doctoral se centró en el estudio del impacto de diferentes tratamientos tecnológicos, que dan lugar a una desnaturalización limitada de la Tesis doctoral de Alba Pablos Tanarro Sensitizing and anaphylactic capacity of egg proteins: processing and food matrix effect / Capacidad sensibilizante y anafiláctica de las proteínas del huevo: efecto del procesado y de la matriz alimentaria proteína, sobre la capacidad alergénica de las proteínas de la clara de huevo. Para este propósito se compararon clara cruda (REW), clara pasteurizada (HEW, 80ºC-10min) y clara presurizada (PEW, 400 mPa-10min). Los ratones sensibilizados y provocados con PEW mostraron reacciones alérgicas más severas. Además, la estimulación de los esplenocitos con los alérgenos indujo mayores niveles de citoquinasde tipo Th2, IL-4 e IL-5, en los ratones sensibilizados con PEW. En relación a la respuesta humoral, la sensibilización con PEW y REW estimuló mayores niveles de IgG1 específica al final del protocolo de sensibilización, mientras que los mayores valores de IgE específica correspondieron a los ratones sensibilizados con HEW. El test de anafilaxia cutánea pasiva confirmó que la inmunoglobulina IgG1 juega un papel importante en las reacciones alérgicas producidas por PEW y REW, pero las reacciones producidas por HEW son principalmente mediadas por IgE. Finalmente, y basándose en información previa que confirma que los componentes de la matriz alimentaria pueden alterar la digestión y absorción gastrointestinal de los alérgenos alimentarios, así como tener un efecto adyuvante que activa la inmunidad innata y mejorar la respuesta inmune específica frente al alérgeno, la última parte de la Tesis Doctoral buscó evaluar la capacidad de la EW y la EY para sensibilizar y producir reacciones alérgicas, prestando especial atención a su influencia mutua sobre la respuesta inmune. Con este propósito, se desarrollaron cuatro modelos animales de alergia a huevo: dos protocolos de sensibilización oral, con y sin adyuvante, un protocolo de sensibilización intraperitoneal y un protocolo de sensibilización epicutánea. Los resultados obtenidos revelaron que la EY podría tener un papel importante durante la fase de sensibilización al huevo, y no tanto sobre la fase efectora de la alergia. Los ratones sensibilizados con EY y la combinación de EW:EY fueron más susceptibles de desarrollar alergia al huevo, presentando una respuesta anafiláctica más severa tras la provocación con EW, así como un incremento de la expresión de GATA-3 e IL-4 y un aumento de la proporción de células Th2 activadas en los nódulos linfáticos mesentéricos. En los estudios ex vivo, la EY también estimuló una mayor producción de citoquinas de tipo Th1 y Th2. Además, la EY, y Tesis doctoral de Alba Pablos Tanarro Sensitizing and anaphylactic capacity of egg proteins: processing and food matrix effect / Capacidad sensibilizante y anafiláctica de las proteínas del huevo: efecto del procesado y de la matriz alimentaria su co-administración con EW, estimuló la expresión de IL-33 en el duodeno. No obstante, la EW, la EY, y su combinación, presentaron una capacidad limitada para estimular la producción inmunoglobulinas cuando no se empleó adyuvante o se sensibilizó a los ratones vía intraperitoneal y epicutánea. En todos los casos, la EY por si sola no desencadenó reaciones anafilácticas. Por tanto, la combinación EW:EY mostró ser más inmunogénica que la EW y la EY administradas individualmente, a juzgar por sus efectos sobre las respuestas Th1 y Th2