Caracterización bioquímica y estructural de enzimas bacterianas y fúngicas implicadas en el metabolismo de azúcaresn-acetil-beta-hexosaminidasas, alfa-glucuronidasas y metalo-beta lactamasas

Zusammenfassung

Este trabajo trata sobre enzimas implicadas en el metabolismo de los carbohidratos por su potencial biotecnológico y biosanitario. Los azúcares son moléculas necesarias para un desarrollo y función adecuados. Por ello, los seres vivos poseen estrategias para su captación, metabolismo y degradación. Así, las enzimas implicadas en su metabolismo tienen una gran relevancia, por lo que profundizar en su estructura y catálisis promete generar un conocimiento muy útil. Desde un punto de vista biotecnológico, este trabajo se centró en enzimas glicosil hidrolasas (GHs), que poseen una función hidrolítica indispensable para cada especie en la que están presentes. Además, poseen actividades diversas, siendo una de las más destacables la de hidrolizar sin pretratamientos la lignocelulosa, lo que facilita la producción de biocombustibles. Por ello, es de suma importancia ahondar en su mecanismo catalítico y condiciones de reacción para progresar en el ámbito de las energías sostenibles. Se eligieron diferentes enzimas con el fin de buscar una mezcla capaz de descomponer esta estructura polisacárida tan resistente. Estas enzimas fueron las N-acetilhexosaminidasas (NAHasas) de Streptomyces lividans y Picrophilus torridus y las alfa-glucuronidasas (AguAs) de Streptomyces bingchenggensis y Talaromyces emersonii. Las dos NAHasas mencionadas pertenecen a las familias GH20 y 3 y las dos AguAs a la GH67. Estas enzimas fueron clonadas, expresadas y purificadas para su caracterización filogenética, catalítica y estructural empleando técnicas como bioinformáticas, rayos X, SAXS o espectrofotometría. Además, se llevaron a cabo estudios de coinmovilización de algunas de las AguAs obtenidas con otras enzimas implicadas en la degradación de carbohidratos (como las endoxilanasas) para describir nuevos biocatalizadores bifuncionales para la mejora en la eficiencia de obtención de biocombustibles. Desde el punto de vista biosanitario, el ascorbato es una fuente de energía en condiciones anaerobias para algunos microorganismos que habitan el intestino humano gracias al regulón ula y a una de las enzimas que codifica, UlaG. Uno de estos organismos es E. coli, primer organismo en el que se describió una UlaG y que dio lugar a la familia UlaGL. Con el fin de dilucidar su mecanismo, se estudiaron una batería de mutantes de la UlaG de E. coli con el fin de entender qué residuos son clave para la actividad. Además, esta enzima podría ser una diana antimicrobiana ya que posee la capacidad de degradar ciertos antibióticos beta-lactámicos. Por ello, caracterizar UlaG es relevante ya que podría actuarse sobre patógenos resistentes a los tratamientos convencionales. Tres de estos patógenos son Streptococcus pyogenes, Clostridium perfringens y Atopobium vaginae. Tantos sus UlaGs (AvUlaG, SpUlaG y CpUlaG) como la de diferentes mutantes de E. coli (EcUlaG) fueron clonadas, expresadas y purificadas. En ellas se realizaron estudios para su caracterización estructural, empleando técnicas como ultracentrífuga analítica. Complementariamente, AvUlaG y SpUlaG pudieron ser estudiadas mediante cristalografía de rayos X permitiendo resolver la estructura tridimensional de ambas. Igualmente, todas las UlaGs se caracterizaron mediante estudios espectrofotométricos, profundizando en la versatilidad de cofactores que pueden ser empleados, la influencia de la fuerza salina y calculando las correspondientes constantes catalíticas. Finalmente, AvUlaG, SpUlaG y CpUlaG demostraron capacidad para inactivar ciertos beta-lactámicos, disminuyendo la zona de inhibición que producen sobre un césped bacteriano.