Molecular mechanisms regulating plant infection in the rice blast fungus Magnaporthe oryzae

Resumen

Magnaporthe oryzae es un hongo ascomiceto filamentoso que produce la enfermedad de la piriculariosis del arroz. Este estudio se ha centrado en la caracterización de dos mutantes de T-DNA de M. oryzae afectados en patogénesis, M1422 y M1373. M1422 está afectado en un gen que codifica un factor de transcripción implicado en control de polaridad (Transcription factor for polarity control 1; Tpc1). El mutante M1373 carece de una proteína implicada en el transporte núcleo-citoplásmico, la exportina-5 (Exp5). Tpc1 es un regulador transcripcional con un dominio de unión a ADN del tipo Zn(II)2Cys6 que sólo se encuentra en hongos filamentosos. La caracterización del mutante Δtpc1 ha permitido la identificación de su posible mecanismo de acción, mediante la regulación de especies reactivas de oxígeno y el control del complejo NADPH oxidasa. Los procesos de oxidación-reducción están afectados significativamente en el mutante Δtpc1, debido a que el gen NOXD, homólogo funcional de la subunidad p22phox de la NADPH oxidasa humana está reprimido. El mutante ΔnoxD en M. oryzae no es capaz de infectar ni hojas ni raíces de arroz. Además este mutante muestra defectos en la repolarización de los filamentos de actina durante la formación del apresorio y en el proceso autofágico, el cual es esencial para la penetración de hojas. Experimentos de inmunoprecipitación han permitido identificar diferentes vías de participación de Exp5 en la virulencia del hongo. Nuestros resultados demuestran que Exp5 interacciona con Rac1, una pequeña GTPasa involucrada en la organización de los filamentos de actina y el crecimiento polarizado, ambos esenciales para la infección fúngica. Exp5 interacciona además con dos proteínas quinasas activadas por mitógenos necesarias para la formación y penetración del apresorio, Pmk1 y Mps1. Para el estudio de la participación de Exp5 en el metabolismo del ARN, se secuenciaron librerías de pequeños ARN de la estirpe silvestre y del mutante Δexp5. Estos experimentos mostraron que la mayoría de los transcritos pequeños en Δexp5 se encuentran en menor número que en la estirpe silvestre, con excepción de los que derivan específicamente de elementos transponibles, que se encuentran en mayor número en Δexp5. Experimentos Northern realizados con sondas para retrotransposones como MAGGY y RETRO5, y tARNs mostraron que el mutante tiene alterados su distribución subcelular, lo que sugiere que Exp5 participa en la translocación de transcritos pequeños derivados de estos elementos. El análisis de pequeños ARNs ha llevado de forma inesperada a la identificación de un nuevo virus ARN en M. oryzae. La proteína RNA polimerasa dependiente de RNA del nuevo virus, muestra similaridades con los micovirus del tipo ourmia y con el género de virus de plantas ourmiavirus. Por esta razón se le ha llamado “Magnaporthe oryzae ourmia-like virus” (MOLV1). SUMMARY M. oryzae is an ascomycetous filamentous fungus that causes one of the most devastating diseases of rice, the rice blast disease. This study is focused on the characterization of two T-DNA mutants with reduced virulence, M1422 and M1373. The M1422 mutant is affected in a gene that encodes the transcription factor for polarity control 1 (Tpc1). The M1373 mutant lacks the orthologue protein of the nucleo-cytoplasmic transporter exportin-5 (Exp5). Tpc1 is a transcriptional regulator that contains a Zn(II)2Cys6 binuclear cluster DNA-binding domain, which is found exclusively in the fungal kingdom. The characterization of the Δtpc1 mutant has allowed the identification of a putative mechanism by which it acts, via the regulated synthesis of reactive oxygen species and control of the NADPH oxidase complex. Oxidation-reduction processes are significantly affected in Δtpc1, likely due in part to the down-regulation of the fungal homologue of the p22phox NADPH subunit, the NOXD gene. M. oryzae ΔnoxD mutant is unable to infect rice. Furthermore, ΔnoxD defects in repolarization of the F-actin cytoskeleton during infection-related development show that Tpc1 is required for penetration, and is also required for infection-associated autophagy. The karyopherin Exp5 in M. oryzae is also necessary for full disease symptoms production. Immunoprecipitation assays have identified several pathways that link Exp5 with fungal pathogenicity. Exp5 interacts with Rac1, a small GTPase involved in actin cytoskeleton organization and polarized cell growth, essential processes required for appressorium formation and function. Exp5 also interacts with two mitogen-activated protein (MAP) kinases that are involved in appressorium-mediated penetration and invasive growth, Pmk1 and Mps1. To ascertain the involvement of Exp5 with RNA metabolism sRNA libraries from wild type and Δexp5 strains have been generated and sequenced. Overall, small transcripts are down-regulated in Δexp5 except those derived from specific transposon elements. Northern blots using sRNA probes for the retrotransposons MAGGY and RETRO5 and tRNAMet suggest that Exp5 is involved in their translocation. In addition, the analysis of the sRNA libraries led us to the discovery of a new RNA virus in the rice isolate Guy11. The viral protein sequence shows similarities with Ourmia-like mycoviruses, and plant viruses from Ourmiavirus genus. For this reason this novel RNA virus has been named Magnaporthe oryzae ourmia-like virus (MOLV1).