Síntesis y caracterización molecular en marinomonas mediterránea de una novedosa proteína antimicrobiana con actividad l-lisina e-oxidasa

Resumen

M. mediterranea MMB-1 es una bacteria marina Gram-negativa que sintetiza en fase estacionaria una proteina antimicrobiana denominada inicialmente marinocina. La actividad antimicrobiana se manifiesta unicamente en medios conteniendo L-lisina y esta mediada por peroxido de hidrogeno, lo que sugiere una actividad lisina oxidasa. En esta Tesis se describe, por una parte, la caracterizacion de la reaccion catalizada por la marinocina, asi como algunas propiedades moleculares de esta enzima. Se demuestra que la marinocina, o LodA, cataliza la desaminacion oxidativa de la L-lisina en el grupo ¿Ã-amino, para producir el del acido 6-semialdehido-2-aminoadipico, peroxido de hidrogeno y amonio. Esta accion catalitica en posicion epsilon constituye un nuevo tipo de L-lisina oxidasa no descrita previamente. Por este motivo ha recibido un nuevo numero por la Comision de Enzimas EC 1.4.3.20. Esta enzima es muy afin y muestra una elevada especificidad para ese aminoacido, actuando sobre el estereoisomero L. Ademas, a diferencia de las L-aminoacido oxidasas convencionales, incluyendo la Llisina ¿¿-oxidasa, que presentan FAD en su centro activo, la marinocina no posee dicho cofactor sino otro cofactor de naturaleza quinonica. En relacion a la distribucion de esta actividad en otras bacterias marinas, se muestra que entre las diversas cepas de Marinomonas aisladas de la microbiota de Posidonia oceanica que se han estudiado, solo la cepa IVIA-Po-186 perteneciente a la especie M. mediterranea, sintetiza un compuesto con actividad antimicrobiana. Esta actividad, al igual que la marinocina, es una lisina oxidasa. Se ha estudiado tambien su distribucion en Pseudoalteromonas luteoviolacea con el fin de dilucidar la naturaleza del ¿gantibiotico macromolecular¿h descrito anteriormente en este microorganismo. Los resultados obtenidos indican que este microorganismo sintetiza una LAO de amplio espectro que difiere de la marinocina en la especificidad de sustrato, mostrando actividad sobre aminoacidos como L-metionina, L-glutamina o L-leucina, pero no sobre L-lisina. Este resultado contrasta con la deteccion en otra especie del mismo genero, P. tunicata, de una proteina muy similar a LodA. En este trabajo se ha demostrado que el gen lodB, localizado aguas abajo de lodA, forma junto con este un operon, denominado lodAB. Estudios de complementacion genica, realizados sobre diversos mutantes de M. mediterranea nulos para la actividad LOD, demuestran que lodB es necesario, junto a lodA, para la expresion de la actividad LOD. La expresion recombinante del operon lodAB en E. coli, tambien indica que es necesaria la expresion de ambos genes para obtener la actividad LOD. En todos los microorganismos que contienen genes similares a lodA y lodB se ha observado que ambos estan consecutivos en el cromosoma, indicando la importancia de la proteina codificada por lodB para la expresion de la actividad lisina oxidasa. LodA se acumula celularmente durante la fase exponencial de crecimiento y se secreta al medio extracelular una vez alcanzada la fase estacionaria. Se observan diferencias electroforeticas entre ambas especies proteicas. La forma celular se corresponde con una banda de masa molecular aparente de 190 kDa, a diferencia de la forma de 140 kDa detectada extracelularmente. Sin embargo, ambas especies son disociables por calor generando un monomero de masa molecular aparente de 95 kDa. La forma celular de esta proteina es activa y contiene el cofactor quinonico. Sin embargo, los resultados obtenidos indican que LodA no es imprescindible para el metabolismo de este aminoacido en M. mediterranea. Por otra parte, LodB es una proteina que presenta un patron de expresion intracelular similar a LodA durante la fase de crecimiento exponencial. Sin embargo, cuando esta ultima proteina se secreta al medio extracelular, los niveles de LodB disminuyen drasticamente. Ademas, en ausencia de LodB no se detecta la forma intracelular activa de LodA, lo que sugiere que podria estar relacionada con la dimerizacion y posible maduracion de dicha forma activa de LodA. La expresion de solo una de las proteinas del operon lodAB de forma aislada supone niveles muy bajos de acumulacion celular para la otra proteina del operon. Este efecto se observa a nivel post-transcripcional y esta relacionado con la estabilidad de ambas proteinas, lo que podria indicar una interaccion molecular entre LodA y LodB que cause tal co-estabilizacion