Optimización del sistema replicativo del bacteriófago ?29 para aplicaciones biotecnológicas

Resumen

Hace años nuestro laboratorio describió un sistema mínimo para la amplificación eficiente in vitro del genoma del bacteriófago ϕ29 basado en 4 proteínas codificadas por el propio virus: la DNA polimerasa, la proteína terminal (TP), la proteína de unión a DNA de banda simple (p5) y la proteína de unión a DNA de banda doble (p6). Sin embargo, hasta el momento no se había desarrollado un sistema similar para la producción de DNAs heterólogos unidos a una TP. En la presente tesis doctoral se ha adaptado el sistema de amplificación cebado por TP a DNAs que no tienen una TP unida inicialmente a sus extremos 5’. Esto se ha realizado mediante el diseño de distintos abordajes que permiten flanquear los DNAs a amplificar con las secuencias terminales del genoma de ϕ29, y se ha demostrado la posibilidad de obtener con ellos una amplificación eficiente in vitro cuyo producto es un DNA heterólogo unido covalentemente a una TP en cada uno de sus extremos 5’. Con el fin de comprender los eventos tempranos y para encontrar orígenes de replicación mejorados para la amplificación cebada por TP, en la presente tesis doctoral se ha realizado un estudio sistemático de diferentes secuencias y estructuras terminales en orígenes artificiales de dsDNA. Se observó que la eficiencia del origen estaba determinada por una combinación de factores, entre ellos la secuencia y el desapareamiento de la doble banda y, además, era necesario el reconocimiento de una estructura tipo ‘origen’ (dsDNA y romo). El origen más eficiente obtenido (30 veces la actividad wild-type) tenía la secuencia CCC en el extremo 3’ de la hebra molde, AAA en el extremo 5’ de la hebra desplazada y los 6 primeros pares de bases desapareados. El incremento en la actividad de los orígenes mejorados parecía ser el resultado de la reducción de una barrera termodinámica en la etapa de transición. Trabajos anteriores han demostrado que el dominio N-terminal de la TP presenta capacidad de unión a DNA de forma inespecífica de secuencia. En la presente tesis doctoral se propuso generar una unión específica como forma de mejorar el acceso de la maquinaria de replicación al origen y, por lo tanto, la eficiencia de replicación. Para ello, se sustituyó el dominio N-terminal de la TP por el dominio de unión a DNA del factor de transcripción GAL4 y se generó una diana de reconocimiento para GAL4 haciendo los mínimos cambios posibles en un origen basado en la secuencia del extremo derecho de ϕ29. Sin embargo, la proteína no resultó funcional, habiendo perdido la capacidad de unión a DNA. La unión del genoma de ϕ29 a la TP, codificada por él mismo, hace del sistema del bacteriófago ϕ29 una plataforma muy interesante para fusionar nuevas funciones a un DNA y desarrollar aplicaciones tipo DNA display. En la presente tesis doctoral, se ha empleado la transposición al azar de GFP en la secuencia de la TP con el objeto de encontrar sitios potenciales de inserción seleccionando 12 proteínas que fueron analizadas con el sistema replicativo de ϕ29. De éstas, una permite una inserción de hasta 17 aminoácidos en su secuencia, manteniendo la funcionalidad de la proteína, y puede ser la base de nuevas tecnologías que aún están en proceso de desarrollo, concretamente para la transferencia de genes