dRYBP transcription-dependent and transcription-independent functions in Drosophila development

Resumen

La regulación de la expresión génica es fundamental para el desarrollo normal y patológico de los organismos ya que una desregulación de la expresión génica puede generar defectos morfogenéticos y enfermedades tales como el cáncer o enfermedades neurodegenerativas. La mosca Drosophila melanogaster es un sistema muy útil para el estudio de la regulación de la expresión génica, ya que posee unas características biológicas idóneas como son su pequeño tamaño, su ciclo de vida corto y su elevada fertilidad. Muy importantemente, las vías de señalización que regulan el desarrollo de esta mosca están muy conservadas en la evolución. Además, el uso de Drosophila ha promovido la generación de herramientas experimentales tanto genéticas como moleculares que no están disponibles en ningún otro sistema modelo, haciendo de este organismo un modelo biológico de elección. Existen numerosos mecanismos, que tienen lugar a diferentes niveles, implicados en la correcta regulación de la expresión génica. La vía de la ubiquitinación está emergiendo como un proceso fundamental para la regulación de la expresión génica. El proceso de ubiquitinación está filogenéticamente conservado y consiste en la adición covalente de una o más moléculas de ubiquitina a la lisina de una proteína diana. Dependiendo de las moléculas de ubiquitina unidas y de cómo se unen unas a otras, las consecuencias fisiológicas en la proteína diana pueden ser variables. Por ejemplo, la monoubiquitinación de histonas está implicada en la regulación de la expresión génica, mientras que la ubiquitinación a través de la -K48 es responsable de la degradación vía proteasoma de la proteína diana, un proceso esencial para mantener los niveles de proteínas en distintas vías como la apoptótica. En esta tesis se han estudiado los mecanismos implicados en la regulación epigenética de la expresión génica y en la apoptosis que controlan el desarrollo de Drosophila, en ambos implicado el proceso de ubiquitinación de proteínas. La regulación epigenética de la expresión génica esta mediada por las proteína Polycomb (PcG) y trithorax (trxG). Estas proteínas se encargan de mantener los estados transcripcionales reprimidos y activados durante el desarrollo y la vida adulta respectivamente. Se tratan de proteínas nucleares asociadas a cromatina que se expresan de forma ubicua que regulan el mantenimiento de la expresión de una gran variedad de genes implicados en múltiples procesos biológicos como proliferación, mantenimiento de la pluripotencialidad de células madre y tumorogénesis. Existen al menos 40 proteínas PcG y trxG descritas por el momento. Los mecanismos de acción de estas proteínas consisten en tres pasos. 1) Unión de proteínas PcG o trxG con dominios de unión a ADN, como PHO y Trl, a secuencias específicas denominadas Polycomb Response Elements (PREs) y Trithorax Response Elements (TREs) en los genes diana. 2) Reclutamiento de proteínas PcG y trxG al ADN formando complejos multiméricos. 3) Modificación post-traduccional de histonas, como metilación, acetilación y ubiquitinación, generando distintos estados de compactación de la cromatina, resultando en distintos niveles de transcripción. Además existe un tercer grupo de genes que codifican para proteínas capaces de interaccionar tanto con proteínas PcG y trxG denominados ETP (Enhancers of Trithorax and Polycomb). Entre los ETPs se encuentra la proteína dRYBP, objeto de estudio de este trabajo de tesis. El gen dRYBP (Ring1B and Yin yang1 Binding Protein) está filogenéticamente conservado y codifica para una proteína de 17kDa que se expresa de forma ubicua a lo largo del desarrollo. dRYBP contiene en su N-terminal un dominio de unión a ubiquitina (UBD) del tipo Nucleoporin Zinc Finger NZF capaz de ubiquitinarse en vertebrados. La falta de función de dRYBP produce diferentes fenotipos que son variables en penetrancia y expresividad, como reducción del tamaño de los órganos y esterilidad en hembras, sugiriendo el papel de dRYBP en multitud de procesos biológicos. Además, también se sabe que altos niveles de la proteína dRYBP inducen apoptosis en la mosca y que su homólogo en vertebrados, RYBP, induce apoptosis en células transformadas. Por otro lado, tanto en Drosophila como en vertebrados, se ha descrito la interacción de RYBP con diferentes proteínas relacionadas con apoptosis. Sin embargo, los mecanismos moleculares a través de los cuales dRYBP/RYBP regulan la apoptosis aún se desconocen. La apoptosis es un proceso que tiene lugar durante el desarrollo para asegurar la correcta morfogénesis del individuo y durante de la vida adulta para eliminar células dañadas. Los mecanismos que controlan la apoptosis se encuentran conservados en la evolución y consisten, en último término, en la activación de una familia de proteasas, las caspasas, a través de señales intrínsecas o extrínsecas. En Drosophila, la vía intrínseca consiste en la activación de las proteínas pro-apoptóticas Reaper, Hid y Grim (RHG) (Wing et al., 2001), que inhiben a DIAP1 (Drosophila Inhibitor of Apoptosis Protein 1) (Hay et al., 1995). Consecuentemente, DIAP1 no puede inhibir a la caspasa iniciadora Dronc, que entonces es capaz de activar a las caspasas efectoras Drice y Dcp-1 produciendo la muerte celular (Fuchs and Steller, 2011; MacKenzie and Clark, 2012; Steller, 1995). Tanto las proteínas RHG como DIAP1 son capaz de ubiquitinarse para ser degradadas por el proteasoma. Por lo tanto, los niveles de RHG así como los de DIAP1 deben ser estrictamente regulados para mantener el balance entre muerte y supervivencia celular, asegurando así el correcto desarrollo del organismo. OBJETIVOS Los objetivos de este trabajo de tesis fueron estudiar la funcionalidad de la proteína dRYBP en dos procesos en los que la ubiquitinación juega un papel esencial: la regulación epigenética de la expresión génica mediada por las proteínas PcG y trxG y la regulación de la apoptosis utilizando Drosophila como sistema modelo. Los objetivos específicos de este trabajo de tesis fueron: 1. Análisis de la función molecular de la proteína dRYBP 2. Estudio de la función de dRYBP en la regulación epigenética de la expresión génica 3. Estudio de la función de dRYBP en la regulación de la apoptosis RESULTADOS 1. Análisis de la función molecular de la proteína dRYBP Mediante el análisis en células S2 de Drosophila y su posterior detección mediante WB hemos descubierto que la proteína dRYBP coexiste en dos formas: dRYBP y dRYBP monoubiquitinada (dRYBPub). Además, hemos generado dos construcciones génicas, una, con la proteína silvestre y otra, una forma truncada en el que el dominio NZF, que contiene el UBD, se encuentra deleccionado. A través de ensayos de ¿pulldown¿ con extractos de proteínas de células S2 hemos descubierto que el dominio NZF es fundamental para la unión de dRYBP a proteínas ubiquitinadas. Además, realizando este mismo tipo de ensayos pero usando histonas, hemos descubierto que dRYBP interacciona con las histonas H2A, H2A ubiquitinada (H2Aub), H2B y H2B ubiquitinada (H2Bub), confirmando su papel en la regulación epigenética de la expresión génica. 2. Estudio de la función de dRYBP en la regulación epigenética de la expresión génica Ensayos de co-inmunoprecipitación con extractos proteicos nucleares de embriones de Drosophila (dNE) muestran que dRYBP interacciona bioquímicamente, por un lado, con las proteínas PcG SCE/dRING y dKDM2 y, por otro lado, con la proteína trxG dBRE1. Sin embargo dRYBP no interacciona bioquímicamente con las proteínas PcG PSC, PC, PH y EZ. Además, a través de la inactivación de dRYBP, Sce/dRing, dkdm2 y dBre1 en Drosophila y el análisis fenotípico de los individuos resultantes demuestran que dRYBP interacciona con Sce/dRing, con dkdm2 para contrarrestar la represión mediada por dKDM2 y con dBre1 para contrarrestar la activación mediada por dBRE1. Para estudiar el papel de dRYBP en la regulación epigenética mediada por PcG y trxG inactivamos por un lado, dRYBP, Sce/dRing, dkdm2 y dBre1 independientemente y, por otro lado, la inactivación simultánea de dRYBP y Sce/dRing, dkdm2 o dBre1 en células S2 posteriormente analizamos mediante WB los niveles de modificaciones post-traduccionales de las histonas. Los resultados muestran que dRYBP promueve, de forma directa o indirecta, la ubiquitinación de H2A y la metilación de la H3K4. Los resultados también indican que dRYBP es capaz de modular la demetilación de la H3K36me2 mediada por dKDM2 y de modular la ubiquitinación de la H2Bub mediada por dBRE1. 3. Estudio de la función de dRYBP en la regulación de la apoptosis Realizando ensayos de co-inmunoprecipitación con dNE hemos demostrado que dRYBP interacciona bioquímicamente con las proteínas SKPA y dCUL1, componentes del complejo SCF E3 ubiquitin ligasa. Además la inactivación en el ala simultanea de dRYBP y skpA, dCUL1 o slmb muestran que dRYBP interacciona genéticamente con el complejo SCF E3 ubiquitin ligasa y que este complejo es dRYBP-SCFSlmb es fundamental para la supervivencia de la mosca. El análisis de la falta de función de cada uno de los componentes del complejo dRYBP-SCFSlmb en el disco imaginal de ala y el posterior análisis mediante inmunohistoquímica de la expresión de caspasa-3-activada (C3), muestran que su inactivación induce expresión de C3 y, por tanto, revela el papel anti-apoptótico de este complejo. El estudio de la expresión de distintos marcadores a través de técnicas inmunohistoquímicas en el disco imaginal de ala y del análisis mediante RT-PCR cuantitativa en células S2 demuestran la regulación por parte de las proteínas dRYBP y SKPA de la vía apoptótica intrínseca. En concreto, la apoptosis inducida por la falta de función de dRYBP y skpA es dependiente de los niveles de expresión del gen pro-apoptótico rpr y de la proteína anti-apoptótica DIAP1. Además la falta de función de skpA induce expresión transcripcional de los genes rpr y diap1, aumenta los niveles de la proteína Rpr y disminuye los niveles de la proteína DIAP1. La proteína SKPA interacciona bioquímicamente con Rpr y DIAP1 en células S2. Nuestros resultados también indican que la sobre-expresión de SKPA disminuye los niveles de expresión de la proteína Rpr en células S2 y también es capaz de rescatar el fenotipo apoptótico que se produce en el ala por la sobre-expresión de Rpr. Por último, hemos mostrado que la sobre-expresión de SKPA es capaz de inhibir la apoptosis que tiene lugar durante el desarrollo y la apoptosis que se produce en respuesta a estrés, confirmando el papel anti-apoptótico del complejo dRYBP-SCFSlmb. DISCUSIÓN En primer lugar, hemos estudiado la funcionalidad del dominio UBD de la proteína dRYBP. Nuestros resultados indican que este dominio es esencial para que dRYBP interaccione con proteínas ubiquitinadas, sugiriendo el posible papel de dRYBP como proteína adaptadora de ubiquitina. Estos datos concuerdan con los resultados previos en vertebrados, en los que muestran que RYBP se une a proteínas ubiquitinadas y ubiquitina a través del NZF. Esta posible función de dRYBP como proteína adaptadora de ubiquitina podría explicar la variedad de fenotipos asociados a la falta de función de dRYBP y la diversidad de proteínas con las que interacciona. También hemos estudiado la función de dRYBP en la regulación epigenética de la expresión génica mediada por PcG y trxG, Nuestros resultados indican que dRYBP forma un complejo represor junto con las proteínas PcG SCE/dRING y dKDM2 (complejo que hemos denominado dRRK) y un complejo activador junto con la proteína dBRE1 (complejo que hemos denominado dRB). El análisis de las interacciones genéticas y moleculares entre los componentes de estos complejo, al igual que el estudio de las modificaciones post-traduccionales de las histonas, sugieren que el complejo dRRK lleva a cabo la represión génica a través de la ubiquitinación de la H2A. Además, la interacción entre dRYBP y dKDM2 contrarresta la demetilación de la H3K36me2 mediada por dKDM2, promoviendo niveles intermedios de H3K36me2 y H3K36me, que podría generar un estado transcripcional intermedio de represión. Por otro lado, nuestros datos también indican que la interacción entre dRYBP y dBRE1 en el complejo dRB contrarresta los niveles de H2Bub mediados por dBRE1, sugiriendo la generación de estados transcripcionales intermedios de activación. Por tanto, la presencia de dRYBP podría ser fundamental para promover niveles intermedios de expresión génica y que podrían estar involucrados en promover la plasticidad epigenética de la regulación mediada por los complejos PcG y trxG durante el desarrollo normal y patológico de los individuos Por último, el hallazgo de la interacción entre dRYBP y el complejo SCF revela una función de dRYBP independiente de la transcripción en la regulación de la apoptosis. Nuestros resultados indican que este complejo dRYBP-SCFSlmb tiene un papel esencial en la inhibición de la vía apoptótica y además, sugieren un modelo en el que esta inhibición ocurre a través de la ubiquitinación de la proteína pro-apoptótica Rpr, para ser degradada por el proteasoma. La validación de este modelo y su estudio en vertebrados podría ayudar a entender mejor los mecanismos moleculares de la inhibición de la apoptosis en el desarrollo normal y de enfermedades En resumen, el análisis genético y bioquímico en este trabajo de tesis revela el papel de dRYBP en la regulación epigenética de la expresión génica y en la regulación de la muerte celular. dRYBP controla estos procesos mediante dos mecanismos: uno, dependiente de transcripción donde dRYBP, junto con las proteínas PcG y trxG, modula los niveles de modificaciones post-traduccionales de histonas. El segundo mecanismo, independiente de la transcripción, donde dRYBP regula la apoptosis a través de su interacción con el complejo SCF E3 ubiquitin ligasa, involucrado en la degradación por el proteasoma de proteínas. Este papel dual de dRYBP dependiente e independiente de la transcripción concuerda con estudios recientes en los que se han visto que otras proteínas del grupo PcG tienen una función independiente de las transcripción. Por ejemplo, la proteína PSC ubiquitina a la CiclinaB, permitiendo la progresión del ciclo celular (Mohd-Sarip et al., 2012). Por lo tanto, el estudio de las proteínas PcG no solo debe centrarse en regulación epigenética si no también en dianas independientes de la transcripción para comprender mejor las bases moleculares del desarrollo de los organismos. CONCLUSIONES 1. La proteína dRYBP coexiste en células S2 de Drosophila en dos formas: dRYBP y dRYBP monoubiquitinada (dRYBPub). Además la proteína dRYBP se une a proteínas ubiquitinadas a través de su dominio NZF. 2. La proteína dRYBP interacciona con las histonas H2A, H2B, H2Aub and H2Bub en células S2 de Drosophila. dRYBP interacciona genéticamente con Sce/dRing, dkdm2 y dBre1 y bioquímicamente, en extractos de proteínas nucleares de embriones de Drosophila (dNE), con SCE/dRING, dKDM2 y dBRE1. 3. dRYBP no interacciona bioquímicamente con las proteínas PSC, PC, PH y EZ y dBRE1 no interacciona con las proteínas SCE/dRING, dKDM2 and EZ en dNE. 4. La inactivación de dRYBP disminuye los niveles de H2A monoubiquitinada (H2Aub) y de H3K4 monometilada (H3K4me). 5. dRYBP contrarresta la demetilación de H3K36me2 mediada por dKDM2 y la ubiquitinación de H2B ubiquitinada (H2Bub) mediados por dBRE1. Estas actividades de dRYBP, por lo tanto, podrían atenuar la represión mediada por dkdm2 y la activación mediada por dBre1. 6. El gen dRYBP interacciona genéticamente con skpA, dCul1 y slmb, componentes del complejo SCF E3 ubiquitin ligasa. Además dRYBP interacciona bioquímicamente con las proteínas SKPA y dCUL1. 7. La inactivación de dRYBP, skpA, dCul1 y slmb induce apoptosis en el disco imaginal de ala y además la apoptosis producida por la inactivación de skpA y dRYBP es dependiente de la expresión del gen pro-apoptótico rpr y de la proteína anti-apoptótica DIAP1. Por lo tanto, la función del complejo dRYBP-SCF es inhibir la vía apoptótica intrínseca. 8. La inactivación de skpA en el disco imaginal de ala y en células S2 de Drosophila, induce la activación transcripcional de rpr y diap1, aumenta los niveles de la proteína Rpr y disminuye los niveles de la proteína DIAP1. Además, en células humanas HEK293 la proteína SKPA interacciona bioquímicamente con las proteínas Rpr y DIAP1. 9. Altos niveles de SKPA rescatan el fenotipo apoptótico en el ala inducido por la sobre-expresión de Rpr. En células humanas HEK293 la sobre-expresión de SKPA reduce los niveles de la proteína Rpr. 10. Altos niveles de SKPA inhiben la apoptosis que tiene lugar durante el desarrollo de la las patas y la apoptosis que tiene lugar en respuesta a rayos-X.