Análisis estructural y funcional de proteínas de la vía alternativa del complemento mediante microscopía electrónica

Resumen

El complemento es un componente esencial de la inmunidad innata y un principal desencadenante de las respuestas inflamatorias. La escisión proteolítica de C3 para generar C3b es el paso central y más importante en la activación del complemento. La comparación de las estructuras cristalinas de C3 y C3b ilustra grandes cambios conformacionales durante la transición de C3 a C3b. La exposición de un grupo tioéster reactivo permite que C3b se una de forma covalente a superficies tales como patógenos o restos celulares apoptóticos. El desplazamiento del dominio que contiene el grupo tioéster (TED) expone superficies ocultas que median la interacción con el factor B del complemento para ensamblar la convertasa C3 de la ruta alternativa (AP). Un paso crítico en la activación del complemento es la formación de la convertasa C3 de la vía alternativa (AP), un complejo bimolecular lábil formado por fragmentos activados de los componentes C3 y factor B que son fundamentales para proporcionar una amplificación exponencial del complemento. La regulación de la C3 convertasa es esencial para mantener la homeostasis del complemento en el plasma y para proteger las células y los tejidos del huésped del daño producido por el complemento. Además, el desplazamiento del TED y su interacción con el dominio de macroglobulina 1 (MG1) genera una superficie extendida en C3b donde los reguladores del complemento factor H (FH), el factor acelerador del desensamblaje (DAF), la proteína cofactora de membrana (MCP) y el receptor de complemento 1 (CR1) puede unirse, mediando el desensamblaje acelerado de la C3-convertasa y la inactivación proteolítica de C3b. El C3b unido a la superficie se proteoliza a iC3b por el factor I y los cofactores apropiados. iC3b interactúa con los receptores del complemento (CR) de la superfamilia de Ig, CR2 (CD21), CR3 (CD11b / CD18) y CR4 (CD11c / CD18) en leucocitos, modulando la inflamación, mejorando la inmunidad mediada por células B y señalizando a los patógenos para la eliminación por fagocitosis. Mediante el empleo de microscopía electrónica, presentamos una estructura a resolución de iC3b (24 Å). iC3b muestra una conformación única con características estructurales distintas de cualquier otro fragmento C3. El anillo de macroglobulina en iC3b es similar al de C3b, mientras que el dominio TED se traslada a ubicaciones más parecidas a donde se encontraba posicionado en el C3 nativo. Una consecuencia de este gran cambio conformacional es la interrupción del sitio de unión del factor B, lo que hace que iC3b no pueda ensamblar una convertasa C3. Este modelo estructural también justifica la disminución de la interacción entre iC3b y los reguladores del complemento y el reconocimiento de iC3b por parte de la CR de la superfamilia Ig, CR2, CR3 y CR4. Estos datos ilustran aún más la extraordinaria versatilidad conformacional de C3 para acomodar una gran diversidad de actividades funcionales. Además, la heterogeneidad conformacional en C3b e iC3b repercute en la regulación del complemento al afectar la interacción con los reguladores. C3 genera secuencialmente varios fragmentos proteolíticos, C3a, C3b, iC3b, C3dg, exponiendo cada uno nuevas superficies, que son sitios de interacción con otras proteínas. C3 y sus fragmentos son dianas terapéuticas y marcadores de activación del complemento. En esta tesis presentamos la caracterización estructural y funcional de cuatro anticuerpos monoclonales (mAbs) generados por la inmunización de ratones deficientes en C3 con una mezcla de fragmentos humanos C3b, iC3b y C3dg, y discutimos sus posibles aplicaciones. Este conjunto incluye tres mAbs que interactúan con C3 nativo e inhiben la activación del complemento AP; dos de ellos al bloquear la escisión de C3 por la AP C3-convertasa y uno al impedir la formación de la AP C3-convertasa. Los sitios de interacción de estos mAbs en las moléculas diana se determinaron resolviendo las estructuras de fragmentos Fab unidas a C3b y/o iC3b usando microscopía electrónica. Un cuarto mAb reconoce específicamente los fragmentos iC3b, C3dg y C3d. Debido a que los mAbs anti-complemento bien caracterizados son poco comunes, los mAbs descritos aquí pueden ofrecer interesantes oportunidades terapéuticas y diagnósticas.