Diseño y optimización de biocatalizadores para su aplicación en la síntesis de carbohidratos en condiciones sostenibles

Resum

La presente Tesis Doctoral tiene como objetivo principal la búsqueda de biocatalizadores, su diseño y optimización, para su posterior aplicación en la síntesis de carbohidratos en condiciones sostenibles. Para ello, se realizó un screening para la búsqueda de nuevas glicosidasas capaces de hidrolizar azúcares activados con grupos p-nitrofenol. De ese estudio se seleccionó la bacteria Bacillus circulans ATC3182 para llevar a cabo la síntesis de disacáridos de interés biológico. En primer lugar se caracterizó el microorganismo (curva de crecimiento, actividad hidrolítica y constantes catalíticas) y se optimizaron las condiciones de reacción (pH, fuerza iónica e inducción de la producción de enzima). Con las mejores condiciones de reacción, se llevó a cabo la síntesis de disacáridos Galß-1,3-GlucNac, obteniendo un rendimiento del 52%. Para completar el estudio, se realizó la inmovilización del microorganismo en agarosa, agar y acrilamida, obteniendo actividad hidrolítica con los dos primeros soportes. Con el fin de optimizar el bioproceso, se realizó la expresión y purificación de la enzima ß-galactosidasa de Bacillus circulans ATC3182 mediante colas de histidina. Con el biocatalizador purificado se realizó el diseño y optimización del proceso de inmovilización, empleando diferente tipo de soportes; soportes polímeros de naturaleza fenólica, nanofibras de carbono y glioxil agarosas. Para todos se determinaron las mejores condiciones de inmovilización (pH óptimo, tiempo de contacto, actividad retenida). Posteriormente, se seleccionaron las mejores condiciones en cada caso y se llevó a cabo la síntesis de Galß-1,3-GlucNac y Galß-1,3-GalNac. Estudios previos del grupo habían revelado que la utilización de disolventes sostenibles (derivados de biomasa, como glicerol o diaminas, y líquidos iónicos) en las reacciones mejoraban los rendimientos y selectividad de la reacción. Por ello, se llevaron a cabo las reacciones en presencia de los diferentes solventes observando para cada caso un comportamiento diferente. En el campo de las glicosidasas, se analizó la actividad de la enzima ¿-fucosidasa de Sulfolobus sulfataricus capaz de sintetizar disacáridos de amplio interés como el ¿-L-Fuc(1,3)-¿-D-Gluc-pNF, el ¿-L-Fuc(1,2)-¿-D-Gluc-pNF y el ¿-L-Fuc(1,3)-¿-D-Fuc-pNF. Dentro de nuestro estudio, se evaluó la influencia de los disolventes sostenibles como co-solventes en la reacción de síntesis, observándose cambios en la regioselectividad de la enzima. Para comprender cómo podía afectar a la estructura terciaria de la proteína, se realizaron estudios de fluorescencia con aquellos disolventes de mayor interés. Se pudo concluir que la presencia de los derivados de biomasa GC4 y DMA1 provocaban cambios conformacionales en la enzima que justificaban las diferencias apreciadas en la síntesis de disacáridos. Por otro lado, con el objeto de obtener carbohidratos modificados regioselectivamente en condiciones sostenibles se empleó otro grupo de enzimas que fueron las lipasas CALB, C. antárctica y Pseudomonas stutzeri. Inicialmente, se caracterizó su actividad hidrolítica con sustratos activados con p-nitrofenol y se llevó a cabo el estudio de optimización de las condiciones de inmovilización en nanofibras de carbono y el soporte comercial Celite 435®. Con las mejores condiciones obtenidas, se llevó a cabo la inmovilización de las enzimas, para su posterior empleo en la desacetilación regioselectiva de galactosa peracetilada. Finalmente, se seleccionó el soporte Celite 435 ® como el de mejor actividad, y se llevó a cabo un estudio de estabilidad térmica. Finalmente, se realizaron estudios de resonancia de plasmón superficial (SPR) para evaluar la interacción entre carbohidratos y la proteína ATIII. Se inmovilizaron los carbohidratos biotinilados sobre superficies funcionalizadas con estreptavidina, y se llevaron a cabo estudios de interacción con la proteína en un rango de concentraciones. Con ello, se pudieron obtener datos cinéticos de interacción.